Nature：车涛等研究为新型高效安全的阿片类镇痛药提供重要信息

慢性疼痛是指持续时间超过3个月的疼痛，通常是由于疾病、损伤或神经系统功能障碍引起的。由于长期的疼痛会对患者的身体和心理产生很大的负担，因此需要采用止痛药来缓解疼痛。阿片类药物 (比如吗啡) 是治疗慢性疼痛最常见的止痛药，对于中度到重度的疼痛的镇痛效果非常明显。但是，这些药物的滥用和成瘾问题在全球范围内都非常严重。根据世界卫生组织的统计数据，全球有约3.5亿人因吸食毒品而导致药物成瘾，其中很大一部分是由于滥用阿片类药物引起的。因此，如何设计安全有效，但副作用较小的止痛药物成为当前急需解决的一大难题。

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阿片类止痛药通过结合位于中枢神经系统和周围神经系统的G蛋白偶联受体（G-protein coupled receptor, GPCR）家族中的阿片受体（Opioid receptor），激活下游七种G蛋白（Gi1、Gi2、Gi3、GoA、GoB、Gz、Ggustducin）信号通路，继而抑制神经元的兴奋性，减少疼痛信号的传导，达到缓解疼痛的目的。阿片受体主要有三种亚型，分别是μ型（MOR）、κ型（KOR）和δ型（DOR）。目前，市场上流行的阿片类止痛药主要包括吗啡、芬太尼、氢吗啡酮、哌替啶等，它们均是靶向MOR受体达到非常有效的镇痛效果。但是，这些药具有很强的成瘾性，过量服用会导致呼吸抑制而引发死亡【1】。

相比之下，靶向KOR受体的药物不但产生有效的镇痛作用，而且没有成瘾性以及呼吸抑制等副作用。这些特质让KOR受体成为了治疗慢性疼痛的明星靶标，开发出更为有效且副作用小的止痛药指日可待。不幸的是，KOR受体激活后会产生致幻作用【2】，这限制了靶向KOR受体药物走向临床应用。因此，理解清楚KOR受体介导致幻作用的分子机理非常重要，这可以为将来设计更为高效且安全的药物提供的重要信息。

Salvinorin A于2002年被研究人员从鼠尾草中提取并鉴定为高选择性的靶向KOR受体的致幻剂【3】，这引起了领域内的广泛关注。为更好地理解该致幻剂如何和KOR受体结合，研究人员们合成了一系列的Salvinorin A的衍生物，统称为Salvinorins, 其中包括methoxymethyl-salvinorin B（momSalB）等，它们都具有一定的致幻作用。因此，Salvinorins无疑成为了众多科学家心中用来研究KOR受体介导致幻作用分子机理的优先选择。更有意思的是，传统的KOR激动剂均属于生物碱，它们含有的氮原子在识别和激活KOR受体时发挥重要作用。然而，Salvinorins属于萜类化合物，不含有氮原子，这让研究人员非常好奇Salvinorins是如何结合和激活KOR受体，以及与生物碱类激动剂相比究竟有什么不同。

此外，以往的大部分研究没有系统研究GPCR偶联的同一G蛋白家族中每种G蛋白信号通路的功能，鲜有研究报道暗示这些G蛋白信号通路可能行使不同的功能。这不禁让人发问，KOR受体偶联的七种G蛋白信号通路的功能有区别吗？如果不一样，那么由KOR介导的镇痛效果以及致幻作用分别是哪种或是哪几种G蛋白信号通路介导的？奠定这些差异性功能的分子基础又是什么呢？

为了回答以上问题，2023年5月3日，圣路易斯华盛顿大学医学院的车涛团队联合马里兰大学生物化学与分子生物学系的Jonathan F. Fay课题组在Nature杂志以长文形式在线发表了题为Ligand and G-protein selectivity in the κ-opioid receptor 的研究论文。该项研究借助低温冷冻电镜解析KOR受体与致幻剂momSalB或是高选择性的KOR激动剂GR89,696分别与胞内信号蛋白Gi1、GoA、Gz以及Ggustducin形成复合物的一系列高分辨率的活性状态结构。这也是首次揭示GPCR结合Gz或Ggustducin的三维结构。

该研究结合多种细胞水平上的功能分析、相关药理学实验手段以及分子动力学模拟等方法，首次阐明了KOR受体介导致幻作用的结构基础，生物碱类和萜类激动剂差异性结合和激活KOR受体的分子机理，以及揭示四种G蛋白被选择性激活的关键氨基酸残基，并首次证明它们在功能上存在显著的差异性等，这系列的发现深化了对于KOR受体信号传导调控的理解和认识，为推动开发新型高效安全的阿片类镇痛药提供重要的信息。具体研究结果如下：

1）通过KOR-momSalB结构分析，设计突变体，结合细胞水平等生化实验揭示KOR受体介导致幻作用的重要元件；2）通过比较KOR受体分别与momSalB和GR89,696的结合口袋，揭示两者差异性结合和激活KOR的结构基础。特别值得一提的是，这是首次借助高分辨的原子模型直观地回答了领域内长期以来一个未解之谜：为何KOR-ASP^3.50 在萜类和生物碱类激动剂激活KOR受体过程中存在很大的差别？（前人发现的奇怪现象：将KOR-ASP^3.50即天冬氨酸残基突变成丙氨酸残基时，生物碱类激动剂 (例如Dynorphin A或U69,593) 无法激活KOR受体，萜类激动剂（例如Salvinorin A）几乎不受影响。当该天冬氨酸残基突变为天冬酰胺时，生物碱类激动剂激活KOR的能力仍然被大幅度削弱，萜类激动剂反而提高了其激活KOR受体的能力【4】）；3）详细比较KOR受体与Gi1、GoA、Gz、Ggustducin的结合模式，借助氨基酸残基突变以及相关实验揭示差异性激活四种G蛋白的关键氨基酸残基。这为以后分别研究G蛋白家族（包括Gs、Gq家族）内部成员的功能提供新思路；4）借助GPCR三元复合物模型理论【5】以及相关同位素结合实验，首次证明这四种G蛋白在功能上存在显著的差异。这系列发现无疑会让研究人员开始重视研究G蛋白家族内部成员的功能，而不再是“一视同仁”了。

据悉，圣路易斯华盛顿大学医学院的博士后韩建明为本文的第一作者。圣路易斯华盛顿大学医学院的车涛教授和马里兰大学的Jonathan F. Fay教授为本文的共同通讯作者。

原文链接：

https://doi.org/10.1038/s41586-023-06030-7

参考文献：

1. Bruchas, M.R. & Roth, B.L. New Technologies for Elucidating Opioid Receptor Function. Trends Pharmacol Sci 37, 279-89 (2016).

2. Pfeiffer, A., Brantl, V., Herz, A. & Emrich, H.M. Psychotomimesis mediated by kappa opiate receptors. Science 233, 774-6 (1986).

3. Roth, B.L. et al. Salvinorin A: a potent naturally occurring nonnitrogenous kappa opioid selective agonist. Proc Natl Acad Sci U S A 99, 11934-9 (2002).

4. Vardy, E. et al. Chemotype-selective modes of action of kappa-opioid receptor agonists. J Biol Chem 288, 34470-34483 (2013).

5. De Lean, A., Stadel, J. M. & Lefkowitz, R. J. A ternary complex model explains the agonist-specific binding properties of the adenylate cyclase-coupled beta-adrenergic receptor. J Biol Chem 255, 7108-7117 (1980).

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